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英文標(biāo)題：Dynamic single-cell metabolomics reveals cell-cell interaction between tumor cells and macrophages

中文標(biāo)題：動(dòng)態(tài)單細(xì)胞代謝組學(xué)揭示腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞之間的細(xì)胞相互作用

發(fā)表期刊：nature communications

影響因子：15.7

研究背景

代謝重編程是腫瘤發(fā)生發(fā)展的核心特征，腫瘤微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的代謝互作調(diào)控二者表型與功能，但其單細(xì)胞水平的動(dòng)態(tài)代謝交流機(jī)制尚未明晰。傳統(tǒng)代謝組學(xué)僅能靜態(tài)檢測(cè)代謝物濃度，無(wú)法反映代謝通路的真實(shí)活性；單細(xì)胞代謝分析與穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)的結(jié)合雖為解析單細(xì)胞代謝動(dòng)態(tài)提供了可能，卻受限于高通量檢測(cè)技術(shù)短板與精準(zhǔn)數(shù)據(jù)解析瓶頸，且常規(guī)共培養(yǎng)分析的分離或標(biāo)記操作易干擾細(xì)胞天然代謝狀態(tài)，難以精準(zhǔn)解析二者直接的代謝互作，同時(shí)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的極化異質(zhì)性也缺乏基于代謝特征的單細(xì)胞分型方法。本研究構(gòu)建高通量、無(wú)標(biāo)記的單細(xì)胞動(dòng)態(tài)代謝組學(xué)分析系統(tǒng)，結(jié)合穩(wěn)定同位素示蹤與機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)，從靜態(tài)濃度和動(dòng)態(tài)活性雙維度解析腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的直接代謝互作規(guī)律，揭示腫瘤微環(huán)境的代謝調(diào)控機(jī)制并實(shí)現(xiàn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的代謝特征精準(zhǔn)分型。

研究結(jié)論

01.動(dòng)態(tài)單細(xì)胞代謝組學(xué)系統(tǒng)的構(gòu)建

研究人員基于適用于群體系統(tǒng)的MetTracer全局同位素示蹤技術(shù)，構(gòu)建了單細(xì)胞同位素示蹤分析流程（圖2a）。系統(tǒng)整體工作流程如圖1所示：細(xì)胞經(jīng)同位素示蹤劑標(biāo)記后，由高通量數(shù)據(jù)采集平臺(tái)（如有機(jī)質(zhì)譜流式設(shè)備）分析，再通過(guò)基于Python的數(shù)據(jù)處理平臺(tái)完成單細(xì)胞基本代謝數(shù)據(jù)處理和同位素示蹤分析，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞水平代謝活性譜分析、交錯(cuò)代謝網(wǎng)絡(luò)流向分析及細(xì)胞間相互作用研究。

關(guān)鍵數(shù)據(jù)處理步驟包括單細(xì)胞脈沖峰選擇、特征峰確定、代謝物注釋及峰強(qiáng)度提取。在該數(shù)據(jù)采集條件下，通過(guò)總離子流(TIC)變化和細(xì)胞標(biāo)志物的提取離子流(EIC)可見，一個(gè)單細(xì)胞脈沖含3-6個(gè)質(zhì)譜圖（圖2b），這與細(xì)胞體積有關(guān)，而代謝物差異可能源于細(xì)胞內(nèi)濃度及鞘液提取效率。

對(duì)10個(gè)細(xì)胞脈沖中特征峰的最大強(qiáng)度保留時(shí)間分析顯示，多數(shù)峰在細(xì)胞脈沖內(nèi)兩個(gè)相鄰質(zhì)譜圖（間隔135ms）即r₁和r₂處達(dá)最大強(qiáng)度（圖2c-d）。其中，m/z 80-500的峰傾向于在r₁達(dá)峰，m/z 500-1000的峰更可能在r₂達(dá)峰，這與不同大小分子的電遷移速率一致。

分別基于m/z 306.0760（谷胱甘肽）、m/z 804.5760（磷脂酰絲氨酸（37:0））及每個(gè)細(xì)胞脈沖最大強(qiáng)度提取的單細(xì)胞代謝物強(qiáng)度熱圖，呈現(xiàn)出顯著不同的代謝譜（圖2e），且通過(guò)兩種不同分子量細(xì)胞標(biāo)志物確定的代謝物比僅用一種更多（圖2f）。

此外，計(jì)算每個(gè)檢測(cè)峰的信號(hào)背景比(SBR)，僅保留SBR>3且在所有細(xì)胞中出現(xiàn)頻率>20%的峰作為細(xì)胞特征峰，為后續(xù)分析奠定基礎(chǔ)。

圖1. 動(dòng)態(tài)單細(xì)胞代謝組學(xué)系統(tǒng)的工作流程示意圖

圖2. 動(dòng)態(tài)單細(xì)胞代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理平臺(tái)

02.單細(xì)胞水平的全局代謝活性分析

為驗(yàn)證系統(tǒng)效果，研究人員以MDA-MB-231細(xì)胞為模型進(jìn)行分析（圖3a）。細(xì)胞在含透析胎牛血清(dFBS)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別用[U-13C]-葡萄糖和[U-13C]-谷氨酰胺標(biāo)記5分鐘至3小時(shí)，經(jīng)優(yōu)化后，3小時(shí)內(nèi)共標(biāo)記出40種代謝物（圖3b）。KEGG富集分析顯示，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、精氨酸生物合成、三羧酸循環(huán)、嘌呤代謝等通路易被該方法標(biāo)記和檢測(cè)（圖3c）。

在兩種同位素標(biāo)記條件下，標(biāo)記代謝物被層次聚類為3個(gè)簇（圖3d），并呈現(xiàn)出不同的時(shí)間進(jìn)程模式：簇1的代謝物在3小時(shí)內(nèi)達(dá)到同位素穩(wěn)態(tài)，標(biāo)記速率最高；簇2和簇3的代謝物3小時(shí)內(nèi)未達(dá)穩(wěn)態(tài)，標(biāo)記速率依次降低（圖3e-f）。通過(guò)非線性擬合計(jì)算各代謝物的標(biāo)記速率(k)，發(fā)現(xiàn)3個(gè)簇中代謝物的標(biāo)記速率與時(shí)間進(jìn)程模式一致（圖3g-h），且這一結(jié)果在KEGG通路注釋中得到驗(yàn)證（如葡萄糖標(biāo)記下，半乳糖代謝和鞘脂代謝的標(biāo)記速率較高；谷氨酰胺標(biāo)記下，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝的標(biāo)記速率較高，圖3i-j）。

圖3. 單細(xì)胞全局代謝活性分析

對(duì)約5000個(gè)經(jīng)[U-13C]-葡萄糖標(biāo)記的單細(xì)胞（涵蓋6個(gè)標(biāo)記時(shí)間點(diǎn)）進(jìn)行分析，基于標(biāo)記程度(LE)特征的UMAP分析識(shí)別出單細(xì)胞亞群（圖4a）。通過(guò)密度聚類算法(DBSCAN)對(duì)所有細(xì)胞進(jìn)行分析，得到A、B、C、D、E、F六個(gè)聚類（圖4b），且各標(biāo)記代謝物的LE從A到F依次升高，表明聚類A-F隨標(biāo)記時(shí)間呈演化趨勢(shì)。不同時(shí)間組的單細(xì)胞在亞群中的分布存在差異（圖4c），如5分鐘、10分鐘、30分鐘、1小時(shí)和3小時(shí)組均包含多個(gè)亞群。這些結(jié)果揭示了代謝活動(dòng)的異質(zhì)性及單細(xì)胞在標(biāo)記時(shí)間上的非同步性，這是傳統(tǒng)批量分析無(wú)法捕捉的。

圖4. 單個(gè)MDA-MB-231細(xì)胞代謝活性的細(xì)胞異質(zhì)性

03.單細(xì)胞水平代謝途徑的相互聯(lián)系與流分析

以[U-13C]-葡萄糖為示蹤劑，UDP-葡萄糖的M6同位素體顯示其己糖部分通過(guò)糖酵解中間產(chǎn)物葡萄糖-1-磷酸在5分鐘內(nèi)快速標(biāo)記（圖5a）；M5標(biāo)記核糖經(jīng)磷酸戊糖途徑和嘧啶代謝生成，使UDP-葡萄糖的M11同位素體在1小時(shí)后出現(xiàn)，而M6標(biāo)記程度在3小時(shí)后顯著降低（圖5b）。此外，三羧酸循環(huán)代謝物檢測(cè)到多種標(biāo)記同位素體（圖5c），相關(guān)代謝物也呈現(xiàn)與循環(huán)階段對(duì)應(yīng)的標(biāo)記模式（圖5d）。

3小時(shí)標(biāo)記樣本的相關(guān)性矩陣分析揭示了單細(xì)胞通路間的關(guān)聯(lián)（圖5e-f）。僅用[U-13C]-乳酸示蹤時(shí)，觀察到M2標(biāo)記的UDP-葡萄糖（圖5g），且[U-13C]-乳酸未產(chǎn)生標(biāo)記尿苷，表明其源于糖異生途徑的己糖標(biāo)記（圖5h）。以[U-13C]-谷氨酰胺為示蹤劑時(shí)，A549細(xì)胞中M3標(biāo)記的蘋果酸和天冬氨酸標(biāo)記程度顯著高于MDA-MB-231細(xì)胞，顯示其還原活性更高（圖5j）。

圖5. 單細(xì)胞水平通過(guò)多種標(biāo)記示蹤劑揭示的代謝流及相互聯(lián)系

04.2-脫氧葡萄糖誘導(dǎo)的單個(gè)MDA-MB-231細(xì)胞中的代謝擾動(dòng)

研究人員比較了對(duì)照與2-脫氧葡萄糖(2-DG)處理?xiàng)l件下MDA-MB-231單細(xì)胞的代謝動(dòng)態(tài)。2-DG通過(guò)抑制己糖激酶阻斷糖酵解，生成2-DG-6P，處理組單細(xì)胞中可檢測(cè)到該物質(zhì)，且細(xì)胞形態(tài)和活力正常。

濃度分析顯示，不同處理時(shí)間的2-DG組與對(duì)照組存在顯著差異代謝物，涉及氨基糖代謝、嘌呤代謝等通路，部分代謝物（如PE、SM、谷氨酰胺）在3小時(shí)處理后濃度升高，可能是應(yīng)對(duì)糖酵解抑制的早期機(jī)制。

動(dòng)態(tài)分析中，UDP-葡萄糖/UDP-半乳糖的豐度無(wú)顯著變化，但經(jīng)[U-13C]-葡萄糖標(biāo)記1小時(shí)后，其LE下降，表明糖酵解活性降低（圖6a）；UDP-GlcNAc的豐度在3小時(shí)處理后不變、過(guò)夜后降低，而其LE在兩處理組均顯著下降（圖6b），且兩種代謝物的標(biāo)記速率在2-DG處理后降低（圖6c-d），體現(xiàn)LE對(duì)短期代謝活性變化的靈敏反映。

層次聚類將標(biāo)記代謝物分為兩簇：簇1的LE降低，涉及糖酵解關(guān)聯(lián)通路；簇2的LE升高，包括TCA循環(huán)等替代能量途徑，且這些代謝物濃度均下調(diào)或無(wú)顯著變化（圖6e-f）。

降維分析顯示，基于相對(duì)強(qiáng)度難以區(qū)分三組單細(xì)胞，結(jié)合LE可基于活性水平有效區(qū)分，而將代謝物相對(duì)強(qiáng)度與LE結(jié)合，區(qū)分效果更優(yōu)（圖6g-h），表明動(dòng)態(tài)代謝組學(xué)是濃度分析的必要補(bǔ)充。

圖6. 2-DG誘導(dǎo)的代謝活性擾動(dòng)和單細(xì)胞聚類分析

05.腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞之間的細(xì)胞相互作用 

研究人員利用該系統(tǒng)分析MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞與THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)體系，共培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)UMAP分析分為兩個(gè)簇（CD45?巨噬細(xì)胞與CD45?腫瘤細(xì)胞，圖7a）。為精準(zhǔn)分類細(xì)胞，開發(fā)了基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)模型（圖7b），訓(xùn)練后驗(yàn)證準(zhǔn)確率達(dá) 98.5%（圖7c），能可靠區(qū)分兩類細(xì)胞。

代謝活性分析顯示，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)與單獨(dú)培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞相比，氧化磷酸化、三羧酸循環(huán)等通路活性顯著變化，且與濃度分析結(jié)果一致（圖7g）。共培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞也呈現(xiàn)代謝適應(yīng)性變化。

TAM中氧化磷酸化、三羧酸循環(huán)相關(guān)代謝物活性顯著升高（圖7h-i），而豐度無(wú)顯著差異；UDP-GlcNAc豐度增加但代謝活性略降（圖7j），提示其積累可能因消耗減少。

圖7. 共培養(yǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的代謝組學(xué)分析

研究總結(jié)

本研究構(gòu)建了結(jié)合同位素示蹤與高通量分析的動(dòng)態(tài)單細(xì)胞代謝組學(xué)系統(tǒng)，通過(guò)MDA-MB-231細(xì)胞代謝活性分析、代謝通路流解析、藥物擾動(dòng)驗(yàn)證及腫瘤-巨噬細(xì)胞互作研究，多維度證實(shí)其有效性。該系統(tǒng)突破傳統(tǒng)批量分析局限，通過(guò)標(biāo)記程度(LE)與濃度數(shù)據(jù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)從靜態(tài)濃度到動(dòng)態(tài)功能的解析，為細(xì)胞異質(zhì)性研究、疾病模型構(gòu)建及精準(zhǔn)治療提供了技術(shù)支撐與理論依據(jù)。

2026年2月9日，百趣生物首席科學(xué)家中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所生物與化學(xué)交叉研究中心朱正江研究員及其團(tuán)隊(duì)在全球生命科學(xué)領(lǐng)域方法論研究頂級(jí)期刊nature methods(IF=32.1)發(fā)表題為“Deep-coverage single-cell metabolomics enabled by ion mobility-resolved mass cytometry”的研究論文。率先使用離子淌度質(zhì)譜流式技術(shù)(ion mobility-resolved mass cytometry technology)，創(chuàng)造性地結(jié)合高通量單細(xì)胞注射技術(shù)和離子淌度質(zhì)譜，顯著提升了單細(xì)胞代謝物檢測(cè)的靈敏度、穩(wěn)定性。