英文標題：Exogenous fatty acid renders the improved salt tolerance in Zygosaccharomyces rouxii by altering lipid metabolism
發(fā)表期刊：LWT
影響因子：6.6
客戶單位：四川大學
百趣提供服務：非靶標代謝流
研究背景
魯氏接合酵母(Z. rouxii)長期以來一直用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，與食品的高品質和特殊風味密切相關。此前研究表明，補充外源脂肪酸可以進一步增強Z. rouxii 的耐鹽性。確切的機制尚未可知，可能是外源性脂肪酸調節(jié)脂質代謝，改變細胞膜中脂質的組成。故而，本研究旨在通過代謝流分析和脂質組學探索相關機制。
研究概覽
研究結論
01.Z.rouxii 吸收同位素標記的外源脂肪酸
代謝流分析結果顯示360種代謝物帶有同位素標記，其中76種代謝物參與KEGG通路。富集分析結果可見（圖1A），同位素在代謝途徑中廣泛分布，特別是在脂質代謝相關途徑。KEGG map01100中可見（圖1B）同位素標記的代謝物分布在六個代謝模塊。大多數(shù)代謝物參與脂質代謝，如磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine, PE)和鞘氨醇(sphingosine, Sph)代謝、脂肪酸代謝、甾醇生物合成。除此之外，聚糖代謝、萜類化合物和聚酮類化合物的生物合成以及氨基酸代謝中亦可見同位素標記代謝物。在鹽脅迫下，這些代謝物之間的代謝通量普遍增加，具體體現(xiàn)在甲酰輔酶A、(3S)-檸檬酰輔酶A、脫磷輔酶A，NAD+、鞘氨醇和麥角甾醇等代謝物上。以上結果證實，進入細胞的外源脂肪酸參與脂質合成和代謝，代謝物間的代謝通量增加。
圖1. 鹽脅迫下Z. rouxii 中參與代謝的標記代謝物的同位素比值和代謝通量分析
02.外源脂肪酸調控鹽脅迫下Z. rouxii 的脂肪酰代謝通量
在鹽脅迫下Z. rouxii細胞內共檢測到16種同位素標記的脂肪酰基（圖2A）：除了外源脂肪酸C12:0，細胞內還檢測到被標記的C13:0、C14:0、C16:0等長鏈脂肪酸，這表明外源脂肪酸被細胞吸收后，作為前體參與了脂肪酸的碳鏈延長過程。此外，C14:1、C16:1、C18:1、C18:2和C18:3的標記檢出提示外源脂肪酸可以調控不飽和脂肪酸的合成。與0 g/L NaCl相比，120 g/L NaCl脅迫下脂肪酰基的同位素比值增加，反映出Z. rouxii 在鹽脅迫下對外源脂肪酸的吸收能力增強（圖2B）。
圖2. 鹽脅迫下Z. rouxii 中同位素標記的脂肪酰基的同位素比值和代謝通量的變化分析
03.鹽脅迫和外源脂肪酸處理下Z. rouxii 的脂質組學分析
研究人員采用PCA模型評估了鹽脅迫和補充外源脂肪酸后Z. rouxii 中脂質譜的變化。結果顯示，不同對比間組別分離度良好（圖3A-D）。火山圖可見120 g/L NaCl vs 0 g/L NaCl對比下差異脂質數(shù)量最多，且在120 g/L NaCl脅迫下，多數(shù)脂質含量增加。此外，添加了外源脂肪酸C12:0后，些許脂質的含量發(fā)生變化（圖3E-H）。韋恩圖可見四個對比策略下的差異脂質數(shù)量（圖3I），共有的4個差異脂質是PC(14:0/18:0)、PC(14:0/16:0)、PI(16:0/16:1)和PS(16:0/22:5)。
鹽脅迫下，溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine, LPC)占比降低，磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol, PI)、磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine, PC)、溶血磷脂酰乙醇胺(lysophosphatidyl ethanolamine, LPE)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)和磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine, PS)比例顯著增加。補充了外源性FA 12:0后，FA和二酰基甘油(diacylglycerol, DAG)的比例有所提高（表1）。以上結果表明，鹽脅迫和外源脂肪酸處理下，Z. rouxii 細胞內脂質含量發(fā)生了變化。
圖3. 鹽脅迫和C12:0添加下Z. rouxii 的脂質組學分析
表1. 不同處理條件下脂質類別的相對含量變化
04.鹽脅迫和外源脂肪酸處理下差異脂質的分類分析
為了探究鹽脅迫和外源脂肪酸添加對Z. rouxii 脂質代謝的影響，研究人員分析了差異脂質的豐度變化（圖4）。變化最大的脂質是PC、PE和PI。在120 g/L的NaCl脅迫下，多數(shù)脂質的含量普遍增加，如DAG、FA、LPC、LPE、PC、PE、PI、PS、磷脂酸(phosphatidic acid, PA)和磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol, PG)。補充外源脂肪酸后，部分三酰甘油(triacylglycerol, TAG)豐度增加。
隨后，分析了鹽脅迫下Z. rouxii 細胞中前10種差異脂質的不飽和度變化（圖5A），發(fā)現(xiàn)PA、PS、PE、PC和PG具有較高的不飽和度。在120 g/L NaCl脅迫下，總脂質不飽和度顯著增加，當補充了FA 12:0，脂質不飽和度降低。添加脂肪酸后PI/PS值略有增加，而在鹽脅迫下這種變化不明顯（圖5B）。鹽脅迫下，PC/PE值下降，而添加脂肪酸后比值變化不顯著（圖5C）。
圖4. 鹽脅迫下Z. rouxii 差異脂質豐度的熱圖
圖5. 差異脂質不飽和指數(shù)和磷脂比值的變化
05.代謝流和脂質組變化的聯(lián)合分析
為了進一步揭示外源性脂肪酸進入細胞后對脂質合成和代謝的調控，研究人員對代謝通量和脂質組變化進行了聯(lián)合分析。外源脂肪酸C12:0首先進入細胞參與膜脂肪酸的合成（圖6A）。然后，脂肪酸生成乙酰輔酶A，參與其他脂質的合成，如DAG、TAG、PS、PE、PC等。最后，游離脂肪酸(free fatty acids, FFA)通過β氧化產(chǎn)生ATP，為酵母細胞提供能量。所有這些脂質的代謝通量均增加（圖6B），其中DAG和PS的通量提高了2倍以上。脂質組學結果顯示，鹽脅迫下脂質FA、PE和PC豐度提高了1.5倍以上，進一步證實了代謝通量分析的結果。此外，代謝通量和脂質組差異脂肪酸的皮爾森相關性分析（圖6C）表明，除了FA 13:0的代謝通量與FA 18:1、FA 22:0的代謝通量以及FA 13:0的代謝通量與FA 16:1、FA 18:1的脂質組豐度呈負相關外，余主要呈正相關。特別是脂質組學中的差異脂肪酸之間表現(xiàn)出顯著的正相關關系。
圖6. 鹽脅迫下補充外源脂肪酸影響Z. rouxii 脂質代謝通量和脂質組變化的簡化示意圖
研究總結
本研究首次采用同位素標記代謝流分析和擬靶向脂質組學聯(lián)合，以探索外源性脂肪酸對脂質合成和耐鹽性的影響。結果表明，13C標記的脂肪酸在Z. rouxii 細胞中可以被檢測到，進一步證明了Z. rouxii 能吸收外源脂肪酸，且在鹽脅迫下吸收率更高。此外，還檢測到了同位素標記的其他脂肪酸或脂質，在鹽脅迫下多數(shù)代謝物的代謝通量增加，提示外源脂肪酸主要調控細胞的脂質合成。134種脂質在鹽脅迫期間表現(xiàn)出不同的豐度。大多數(shù)脂質豐度增加，總脂質不飽和度提高。Z. rouxii 增強了整體脂質的合成，提升了代謝通量和脂質含量，進而抵抗鹽脅迫。總的來說，這些發(fā)現(xiàn)為食品酵母中脂質和脂質衍生化學品的綠色生物制造生產(chǎn)提供了技術支持。
