文章標題：FoxO1/PINK1/Parkin-dependent mitophagy mediates the chondroprotective effect of Guzhi Zengsheng Zhitong decoction in osteoarthritis
發表期刊：Phytomedicine
影響因子：8.3
客戶單位：山西醫科大學
百趣提供服務：DIA中藥入血組
研究背景
骨關節炎(Osteoarthritis, OA)是骨科領域的重大挑戰，隨人口老齡化對生活質量的影響和醫療經濟負擔日益顯著，軟骨細胞功能障礙是疾病進展的核心環節。FoxO1轉錄因子可通過介導線粒體自噬維持軟骨細胞穩態，是OA治療的潛在靶點，而針對FoxO1-線粒體自噬軸的中藥相關研究仍較為有限。國醫大師劉柏齡基于“補腎壯骨”理論研發的骨質增生止痛湯(Guzhi Zengsheng Zhitong Decoction, GZZD)，臨床治療OA療效顯著、不良反應低，前期研究證實其可調節軟骨細胞增殖分化、平衡骨代謝，但對線粒體穩態調控的具體機制尚未明確。本研究通過多組學整合分析結合分子生物學技術，闡釋GZZD通過FoxO1調控線粒體自噬保護軟骨細胞的作用機制并鑒定其活性成分，為OA的FoxO1靶向治療及傳統中藥理論的現代化闡釋提供科學依據。
研究結論
01.GZZD減輕MIA誘導的大鼠骨性關節炎
如圖1A所示，作者通過膝關節腔內注射碘乙酸鈉(MIA)建立了大鼠OA模型。注射后，OA組大鼠股骨頭軟骨顯著增生，股骨髁損傷嚴重，滑膜明顯紅斑、增厚，關節組織呈淡黃色改變，與既往報道一致，提示造模成功。與OA組相比，口服硫酸葡萄糖胺(Glucosamine sulfate, GS)或GZZD均能顯著改善軟骨增生，減輕股骨髁紅斑，抑制OA樣病變。
H&E、甲苯胺藍及番紅固綠染色顯示，OA大鼠出現軟骨變薄、表面缺損、骨小梁壞死及纖維組織增生（圖1B）。GS及高、低劑量GZZD均顯著緩解上述病理改變。依據番紅固綠染色計算的OARSI評分，OA組顯著升高，提示軟骨損傷重、進展快（圖1C）；給藥后評分極顯著下降，表明疾病進展減緩。
ELISA檢測血清IL-1β、IL-6、TNF-α（圖1D-F）發現，OA大鼠三種炎癥因子顯著升高，提示炎癥反應強烈；GZZD治療后其濃度顯著下降，顯示GZZD在OA進程中具有顯著抗炎作用。
Micro-CT（圖1G）顯示，OA誘導后股骨髁軟骨下骨被嚴重侵蝕，骨組織破壞廣泛；GZZD有效保護骨組織免受進一步損傷，且能部分恢復骨量。骨體積分數(BV/TV)是骨量關鍵指標，OA組顯著降低，GZZD可使其部分恢復；骨表面積及結構模型指數(SMI)亦在OA模型中顯著下降，經GZZD給藥后得到改善（圖1H-J）。
圖1. 口服GZZD減輕MIA誘導的大鼠骨性關節炎
02.GZZD對骨性關節炎軟骨細胞的保護作用
鑒于GZZD能抑制OA大鼠軟骨破壞，該研究選擇進一步在軟骨細胞層面驗證其保護機制，聚焦以下關鍵蛋白：基質降解酶MMP13、結構蛋白COL2A1、促炎因子IL-1β及抗凋亡蛋白BCL2。結果如圖2A-B 所示：OA模型中MMP13與IL-1β顯著上調，COL2A1與BCL2明顯下調，提示炎癥活躍、軟骨降解并伴隨軟骨細胞凋亡；GZZD干預可逆轉上述變化，下調MMP13和IL-1β，上調COL2A1與BCL2水平。表明GZZD在體內兼具促合成、抑分解、抗凋亡及抗炎作用，從而減緩OA進展。
為了評估GZZD含藥血清對軟骨細胞的影響，使用CCK-8法檢測細胞活力。CCK-8結果顯示，10%及以下濃度均可顯著提升原代軟骨細胞活力，2.5%濃度效果最佳。在IL-1β誘導的體外OA模型中（圖2C-D），中、高劑量含藥血清顯著抑制MMP13的mRNA與蛋白表達，同時上調聚集蛋白聚糖(ACAN)的mRNA與蛋白水平；空白血清組與模型組間無差異，證實起效的是GZZD活性成分而非血清本身。綜上，GZZD在體外同樣能緩解IL-1β誘導的OA損傷，進一步支持其作為OA治療候選藥物的潛力。
圖2. GZZD保護軟骨細胞免受OA誘導的損傷
03.GZZD保護線粒體功能，抑制軟骨細胞凋亡
在OA中，線粒體自噬受損會導致線粒體功能障礙和凋亡增加，從而加速軟骨細胞退變和軟骨破壞。透射電鏡(TEM)顯示，IL-1β誘導的OA軟骨細胞出現明顯線粒體異常（圖3A-B）：嵴斷裂、內膜腫脹、膜完整性喪失，提示線粒體嚴重受損。GZZD給藥后，線粒體結構、膜完整性及數量均得到恢復。
線粒體損傷可通過線粒體途徑觸發凋亡，其早期標志為線粒體膜電位(MMP)去極化，表現為JC-1聚合物（紅色）/單體（綠色）比值下降。MMP染色顯示，與對照組相比，OA軟骨細胞紅色熒光顯著減弱、綠色熒光增強（圖3C-D），表明MMP丟失；GZZD以劑量依賴方式恢復MMP，空白血清組與模型組無顯著差異。
正常情況下，線粒體通透性轉換孔(Mitochondrial permeability transition pore, MPTP)處于關閉狀態；線粒體損傷可致MPTP異常開放，鈣黃綠素綠色熒光減弱或消失。與對照組相比，模型組綠色熒光顯著降低（圖3E-F），提示MPTP過度激活；GZZD含藥血清劑量依賴性地恢復綠色熒光，表明MPTP活性趨于正常。
氧化應激是線粒體損傷的常見驅動因素，也是OA的標志之一。軟骨細胞ROS水平檢測顯示，模型組綠色熒光強度顯著升高；GZZD含藥血清各濃度均可顯著降低ROS水平（圖3G-H）。
軟骨細胞凋亡是OA的關鍵病理特征，且與預后不良反應密切相關，其中線粒體途徑起核心作用。Annexin V-FITC/PI染色表明，正常條件下軟骨細胞凋亡極少，IL-1β處理后凋亡率顯著升高，而GZZD可劑量依賴性抑制IL-1β誘導的凋亡（圖3I）。Caspase家族是凋亡的執行者，其活性在凋亡中顯著升高。IL-1β顯著升高caspase-3、-8、-9活性，GZZD以劑量依賴方式顯著降低其活性，與染色結果一致（圖3J）。
OA大鼠膝關節軟骨TUNEL熒光染色顯示，軟骨層凋亡細胞顯著增多（圖3K）；GZZD兩劑量均顯著減少凋亡，表現出強效抗凋亡作用，而陽性藥GS僅呈輕微效果。綜上，GZZD在體內外均可顯著抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡。
圖3. GZZD維持線粒體完整性并抑制軟骨細胞凋亡
04.GZZD入血成分鑒定與多組學整合分析
采用高效液相色譜(HPLC)對GZZD提取物進行定性分析，與文獻報道的6個質量標志物標準品進行峰對齊驗證。結果如圖4A所示，GZZD與所有質量標志物完全對應。
隨后利用LC-MS/MS鑒定入血原型成分。負離子模式檢出49,772個特征峰，鑒定出179種化合物；正離子模式檢出45,633個特征峰，鑒定出383種化合物。最終確定61種僅在“GZZD提取物+含藥血清”中檢出、而對照血清未檢出的原型入血成分；經文獻及數據庫比對，最終確認11種化合物，包括7種黃酮、1種酯類、1種苯丙素、1種萜類及1種酚類。總離子流圖(TIC)見圖4B-C。
RNA差異表達分析顯示：OA vs Sham共得4,500個DEGs；GZZD vs OA獲得531個DEGs，其中414個上調、117個下調（圖4D）。取Sham-OA與GZZD-OA交集，得到454個共同DEGs。疾病數據庫收錄5,562個OA相關靶點；GZZD成分預測到240個潛在靶點。將轉錄組DEGs轉換為人源基因后，三者Venny交集獲得14個核心靶標（圖4E）。KEGG富集提示HIF-1、FoxO和IL-17信號通路與OA密切相關（圖4F）。經文獻剔除非OA相關通路，結合網絡藥理學最終鎖定11個核心靶蛋白及7個關鍵活性成分，構建 "成分-靶點-通路" 網絡（圖4G）。
圖4. 入血成分鑒定及多組學整合分析
05.GZZD調節FoxO1促進線粒體自噬
線粒體自噬是選擇性自噬的一種，可清除受損線粒體、降低氧化應激和炎癥，從而保護軟骨免受損傷。FoxO1是維持線粒體穩態和自噬功能的關鍵轉錄因子，可通過下游調控ATG7、ULK1、PINK1、Parkin等分子介導線粒體自噬，維持細胞完整性。結果顯示，IL-1β誘導的OA軟骨細胞中FoxO1的mRNA和蛋白表達均顯著降低（圖5A-C）；GZZD處理可恢復FoxO1水平，并在mRNA層面上調其下游靶點ULK1、ATG7、LC3B和PINK1。蛋白檢測進一步表明，模型組LC3B、PINK1、Parkin顯著下降，P62升高，提示自噬流受阻、線粒體自噬受損（圖5D-F）；GZZD逆轉上述變化，升高LC3B、PINK1、Parkin，降低P62，有效恢復自噬流并激活線粒體自噬，減輕IL-1β誘導的線粒體損傷。此外，在OA大鼠軟骨中，GZZD同樣顯著提升FoxO1、LC3B、PINK1和Parkin的表達（圖5G-J）。這些結果共同表明，GZZD通過FoxO1/PINK1/Parkin通路增強線粒體自噬，改善線粒體功能障礙，從而保護OA軟骨。
圖5. GZZD調控FoxO1激活PINK1/Parkin通路并促進線粒體自噬
06.FoxO1在GZZD介導的軟骨細胞保護中的關鍵作用
為明確GZZD是否通過FoxO1發揮軟骨細胞保護作用，采用siRNA沉默FoxO1并觀察其對藥效的影響。在測試的3個FoxO1-siRNA中，siRNA-3沉默效率最高（圖6A-C），被選擇用于后續實驗。沉默FoxO1后，GZZD對IL-1β誘導OA軟骨細胞的保護作用幾乎消失（圖6D-E）：MMP13水平與OA+空載體組相比無顯著差異，ACAN表達較GZZD+載體組顯著降低，提示保護功能喪失。
進一步檢測自噬相關基因發現，FoxO1缺失阻斷了GZZD對LC3B、PINK1、ATG7和ULK1轉錄的調控作用（圖6H）。蛋白層面亦證實，FoxO1沉默削弱GZZD誘導的線粒體自噬：LC3-II/LC3-I比值下降、P62升高，PINK1/Parkin通路被抑制（圖6F）。上述結果凸顯FoxO1在GZZD激活PINK1/Parkin依賴性線粒體自噬中的核心地位。
在線粒體功能方面，FoxO1敲減同樣抵消了GZZD的保護效應（圖6I-N）。siRNA沉默后，GZZD無法恢復線粒體膜電位、降低膜通透性或減少ROS水平。凋亡實驗進一步顯示，FoxO1缺失削弱了GZZD的抗凋亡活性：凋亡率升高（圖6O）、caspase活性增強（圖6P）、BCL-2表達下降（圖6G）。綜上表明，GZZD抑制OA軟骨細胞凋亡主要依賴FoxO1介導的線粒體途徑。
圖6. FoxO1在GZZD調控線粒體自噬激活以保護軟骨細胞中的作用
研究總結
本研究證實，GZZD可有效緩解大鼠OA進展，在體內外均表現出軟骨保護作用，其機制主要依賴于維持線粒體穩態，進而抑制軟骨細胞凋亡。GZZD通過激活FoxO1，調控PINK1/Parkin信號通路，恢復線粒體自噬，保護線粒體完整性，從而抑制細胞凋亡，展現出綜合治療潛力。計算機模擬分析進一步預測，蘆丁和獐牙菜苷是GZZD中靶向FoxO1的關鍵活性成分。這些發現不僅為中醫療法治療OA提供了科學依據，也為開發以FoxO1為靶點的OA治療策略開辟了新思路。
